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本试剂盒提供了一步法配制SDS-PAGE凝胶所需的各种试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可连续灌注下层胶和上层胶通过一步法配制SDS-PAGE胶。本试剂盒也可用于配制非变性PAGE凝胶，即Native-PAGE凝胶。

• 本试剂盒使用一步法配胶，快速高效。本试剂盒优化了配方，按照使用说明将相应溶液混合，补充适量蒸馏水，再加入适量10%凝胶聚合催化剂溶液，混匀后即可灌胶。灌注下层胶(即分离胶)后，无需液封可直接加入上层胶(又称浓缩胶、堆积胶或积层胶)，一步完成制胶，节约配胶时间。
  
• 本试剂盒无须添加TEMED，避免异味。TEMED易挥发，有腐蚀性，有臭味，本试剂盒进行了优化，相应试剂中预添加了易挥发TEMED液体的替代物，正常情况下，配胶过程中无须再额外添加TEMED。
  
• 本试剂盒上层胶为红色，指示清晰。本试剂盒的上层胶缓冲液含电泳时无迁移的红色染料，可使蛋白上样孔一目了然，便于上样，且易于判断上样孔是否歪曲或破损。该红色染料可以稳定存在于上层胶中，不会随着电泳进入下层胶，不影响电泳和染色效果，有助于电泳后辨别并切除上层胶，便于后续转膜等实验的进行。
  
• 本试剂盒配制的SDS-PAGE凝胶，具有优良的分离效果。电泳后蛋白条带平整、清晰、细腻、锐利，特别是小分子蛋白质条带更清晰。

• 试剂盒中的30% Acr-Bis(29:1)、1M Tris-HCl,pH8.8、1M Tris-HCl,pH6.8 (红色) 4℃避光保存。10% SDS、凝胶聚合催化剂可以室温保存。凝胶聚合催化剂配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。
  
• 凝胶聚合催化剂配制成10%溶液后，应当-20℃保存，推荐使用超纯水配制。同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。凝胶聚合催化剂每次应适量配制，并尽量使用新鲜配制的10%凝胶聚合催化剂溶液。超纯水推荐使用无菌超纯水(货号：YT999)。
  
• 本制品相应试剂中预添加了TEMED替代物，如需进一步加速凝胶，可按需补充适量TEMED。
  
• 1M Tris-HCl,pH6.8 (红色)长期静置后可能会出现沉淀，不影响正常使用，使用前请摇晃均匀。
  
• 30% Acr-Bis (29:1)对人体有毒，操作时请特别小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

• 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的下层胶(即分离胶)。
  不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围：
  

  SDS-PAGE分离胶浓度	最佳分离范围
  6%胶	50～150kDa
  8%胶	30～90kDa
  10%胶	20～80kDa
  12%胶	12～60kDa
  15%胶	10～40kDa

  
  
• 称取适量凝胶聚合催化剂，用超纯水或其它高纯度的水配制10%凝胶聚合催化剂溶液。例如称取0.1g凝胶聚合催化剂，用超纯水溶解并定容到1mL，即为10%凝胶聚合催化剂溶液。
  
  • 凝胶聚合催化剂配制成溶液后容易失效，建议分装后置于-20℃保存，通常半年内有效。超纯水推荐使用无菌超纯水(货号：YT999)。
• 配制一块常用PAGE胶(胶板宽度为10厘米)所需下层胶和上层胶体积(下层胶按6厘米高度计算，上层胶按1.5厘米高度计算，均含约0.3mL的冗余量)参见下表。

  凝胶厚度	下层胶体积	上层胶体积
  0.75mm	4.0mL	1.0mL
  1.0mm	5.4mL	1.5mL
  1.5mm	8.0mL	2.0mL

  
  注：下层胶体积已包含适量冗余，请勿全部用于灌制下层胶，以免灌胶时上层胶高度不够。
  
• 参考下表，配制不同浓度的SDS-PAGE下层胶。适当混匀后倒入到制胶模具中，无须等待下层胶凝固，可直接将配制好的上层胶紧贴玻璃板均匀注入，随后小心插入梳子等待凝固，通常10～30分钟内胶会凝固。也可以用蒸馏水或异丙醇封住液面，直至下层胶充分凝固后再加入上层胶。
  
  • 具体的凝固时间和温度及光照有关，说明书中10%凝胶聚合催化剂的推荐用量是室温为25℃时的用量。为达到与25℃时相近的凝固时间，当室温低于25℃时，可以适当加大10%凝胶聚合催化剂用量或额外补加适量TEMED以加快凝胶速度。
    
  • 如果配制非变性胶，参考下表配方，不加10% SDS即可配制成非变性PAGE胶。

  成分	配制不同体积SDS-PAGE下层胶所需各成分的体积(mL)
  6%胶	5	10	15	20	30	50
  超纯水或蒸馏水	2.0	4.0	6.0	8.0	12.0	20.0
  30% Acr-Bis (29:1)	1.0	2.0	3.0	4.0	6.0	10.0
  1M Tris,pH8.8	1.9	3.8	5.7	7.6	11.4	19.0
  10% SDS	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5
  成分	配制不同体积SDS-PAGE下层胶所需各成分的体积(mL)
  8%胶	5	10	15	20	30	50
  超纯水或蒸馏水	1.7	3.3	5	6.7	10.0	16.7
  30% Acr-Bis (29:1)	1.3	2.7	4.0	5.3	8.0	13.3
  1M Tris,pH8.8	1.9	3.8	5.7	7.6	11.4	19.0
  10% SDS	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5
  成分	配制不同体积SDS-PAGE下层胶所需各成分的体积(mL)
  10%胶	5	10	15	20	30	50
  超纯水或蒸馏水	1.3	2.7	4.0	5.3	8.0	13.3
  30% Acr-Bis (29:1)	1.7	3.3	5.0	6.7	10.0	16.7
  1M Tris,pH8.8	1.9	3.8	5.7	7.6	11.4	19.0
  10% SDS	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5
  成分	配制不同体积SDS-PAGE下层胶所需各成分的体积(mL)
  12%胶	5	10	15	20	30	50
  超纯水或蒸馏水	1.0	2.0	3.0	4.0	6.0	10.0
  30% Acr-Bis (29:1)	2.0	4.0	6.0	8.0	12.0	20.0
  1M Tris,pH8.8	1.9	3.8	5.7	7.6	11.4	19.0
  10% SDS	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5
  成分	配制不同体积SDS-PAGE下层胶所需各成分的体积(mL)
  15%胶	5	10	15	20	30	50
  超纯水或蒸馏水	0.5	1.0	1.5	2.0	3.0	5.0
  30% Acr-Bis (29:1)	2.5	5.0	7.5	10.0	15.0	25.0
  1M Tris,pH8.8	1.9	3.8	5.7	7.6	11.4	19.0
  10% SDS	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.5

• 按照如下表格配制4%或5%的SDS-PAGE上层胶。下层胶灌注后，直接将配制好的上层胶紧贴玻璃板均匀轻柔注入到下层胶上，小心插入梳子等待凝固。
  
  • 含红色染料的1M Tris-HCl,pH6.8使用前须摇匀。
    
  • 一步法直接加入上层胶时建议配制4%的上层胶以达到更好的分层效果，也可根据需求自行配制不同浓度的上层胶。
    
  • 一步法直接加入上层胶混合液时一定要轻缓并左右平移加入，而不是集中在一个位置灌制，以免上层胶溶液冲入下层胶而破坏上下层胶分界线的平整度，建议使用1mL移液器缓慢、均匀、左右平移加入。
    
  • 一步法直接加入上层胶混合液，上下层胶分界线的平整度可能会稍差于液封法，但不影响后续电泳结果。

  成分	配制不同体积SDS-PAGE上层胶所需各成分的体积(mL)
  4%胶	2	3	4	6	8	10
  超纯水或蒸馏水	1.44	2.16	2.89	4.33	5.77	7.22
  30% Acr-Bis (29:1)	0.27	0.4	0.53	0.8	1.07	1.33
  1M Tris,pH6.8 (红色)	0.25	0.38	0.5	0.75	1.0	1.25
  10% SDS	0.02	0.03	0.04	0.06	0.08	0.1
  10%凝胶聚合催化剂	0.02	0.03	0.04	0.06	0.08	0.1
  成分	配制不同体积SDS-PAGE上层胶所需各成分的体积(mL)
  5%胶	2	3	4	6	8	10
  超纯水或蒸馏水	1.4	2.1	2.7	4.1	5.5	6.8
  30% Acr-Bis (29:1)	0.33	0.5	0.67	1.0	1.3	1.7
  1M Tris,pH6.8 (红色)	0.25	0.38	0.5	0.75	1.0	1.25
  10% SDS	0.02	0.03	0.04	0.06	0.08	0.1
  10%凝胶聚合催化剂	0.02	0.03	0.04	0.06	0.08	0.1

• 配制好的凝胶如果当天不能使用，可在4℃保存1～2天后使用，但通常新鲜配制凝胶的电泳效果更佳。
  
• 具体的电泳及Western实验操作可以参考Western实验步骤及试剂。